Можно ли повысить уровень нк клеток. Как повысить иммунитет с помощью NK-клеток натуральных киллеров

Естественные, или нормальные, киллеры (NK-клетки - аббр. от англ. Natural Killer )

изначально были описаны как большие гра­нулярные лимфоциты, способные распознать в организме некоторые виды раковотранс-формированных клеткок и уничтожить их без предварительной подготовки. Этот факт обус­ловил название клеток. Рецепторный аппарат и механизм действия естественных киллеров (ЕК) долгое время оставались неясными.

Сейчас установлено, что ЕК имеют морфоло­гию малых лимфоцитов, на их долю приходится около 15 % всех лимфоцитов. Они происходят из общей лимфоидной клетки-предшественницы, мигрируют с кровотоком, но отсутствуют в лимфе. Обнаруживаются в печени, селезенке, слизистых, матке. По маркерам, местам типичной локализа­ции и эффекторным механизмам выделяют две субпопуляции ЕК - «кровяную» и «тканевую».

Рецептор к МНС I класса анализирует плот­ность экспрессии этого маркера на мембране клетки. Дефицит этих молекул, наблюдаю­щийся при раковой трансформации клеток, также потенцирует цитотоксичность ЕК.

« Тканевые» ЕК ведут более оседлый образ жизни и обнаруживаются в большом количестве в пече­ни и децидаульной оболочке беременной матки. Несут маркер CD^CDSe"" 0 ™ и много Еэв-лиганда. Реализуемый эффекгорный механизм - антитело-независимая клеточно-опосредованная цитоток-

сичность (см. разд. 11.3.2). Клетками-мишенями являются лимфоциты, активированные пищевы­ми антигенами или аллоантигенами плода.

Помимо цитотоксических функций, ЕК вырабатывают цитокины (ИЛ-5, -8, у-ИФН, ФНО, гранулоцит-моноцит-колониестимули-рующий фактор - ГМ-КСФ и др.), активи­рующие макрофагально-фагоцитарное звено, развитие иммунного ответа и иммунного воспа­ления. Эффекторная функция ЕК усиливается цитокинами (ИЛ-2, -4, -10, -12, у-ИФН и др.).

ΓδТ-лимфоциты

Среди Т-лимфоцитов существует малочис­ленная популяция клеток с фенотипом, пре­имущественно CD4CD8, которые несут на своей поверхности особый TCR уб-типа. Это удТ-лимфоциты. Они практически полностью локализуются в эпидермисе и слизистой же­лудочно-кишечного тракта. Их общая числен­ность невелика - менее 1 % от общего пула Т-лимфоцитов, однако в покровных тканях может достигать 10 %.

Антигенный рецептор убТ-лимфоцита схо­ден с BCR, его активный центр непосредс­твенно связывается с эпитопом антигена. В отличие от а(3-типа, ySTCR не требует для рецепции процессинга антигена, а также его презентации в комплексе с молекулами МНС. Антигенные детерминанты могут быть пред­ставлены, например, молекулами CD1.

Иммунорецептор у8Т-лимфоцита обладает узким «репертуаром» специфичности. Клетки ориентированы на распознавание некоторых широко распространенных микробных ан­тигенов (липопротеинов, белков теплового шока, бактериальных суперантигенов и др.). Клетки принимают участие в удалении патоге­нов на ранних этапах противоинфекционной защиты.

у8Т-лимфоциты могут быть как эффекторны-ми, цитотоксическими клетками, так и регуля­торами иммунореактивности. Они синтезируют цитокины, активирующие местный иммунитет и локальную воспалительную реакцию, в том числе усиливают образование Т2-хелперов. Кроме того, Тб-клетки продуцируют ИЛ-7 и контролируют тем самым численность собственной популяции.

Установлено, что убТ -лимфоциты проис­ходят из автономного ростка в покровных

тканях, образованного стволовыми клетка­ми, мигрировавшими туда на ранних эта­пах эмбриогенеза. В созревании минуют ти­мус. Активируются клетками поврежденного эпителия ЖКТ и эпидермиса. Размножение уб-клеток усиливается под действием ИЛ-7.

Естественными киллерами крови называют большие лимфоциты, содержащие большое количество цитологических ферментов. Эти лимфоциты на поверхности мембраны имеют специальные рецепторы, с помощью которых они узнают инфицированные вирусами, стареющие, поврежденные, опухолевидные и другие клетки представляющие опасность для организма. Связавшись с ними, они с помощью ферментов цитоплазмы инактивируют и уничтожают их.

Имеются 2 основные популяции и 2 специфические субпопуляции NK-клеток.

Основные популяции NK-клеток:

Лизирует инфицированные вирусами, поврежденные и стареющие клетки;

Находятся в печени и матке и убивают любые лимфоциты, которые активируются пищевыми антигенами и антигенами плода, обуславливая их устойчивость к этим чужеродным для организма веществам.

Специфические субпопуляции NK-клеток:

Лимфокинактивированные (ЛАК-клетки) цитотоксичные к опухолевым клеткам, активируют Т-лимфоциты и эозинофилы;

Киллерные клетки (К-клетки) находятся в барьерных органах и слизистых оболочках, лизируют возбудителей туберкулезаи оппортунистических инфекций.

Кроме прямого киллерного эффекта NK-клетки осуществляют связь, между врожденным и приобретенным иммунитетом стимулируя последний, и принимает активное участие в сохранении постоянства гомеостаза организм.

Тимусзависимые лимфоциты (Т-лимфоциты)

Это те лимфоциты, которые прошли подготовку в вилочковой железе (тимусе)

Функция T-лимфоцитов

Т-лимфоциты играют важную роль в трех функциях иммунной системы:

1. В клеточном иммунитете.

2. В регулировании активности В-клеток.

3. В гиперчувствительности замедленного (IV) типа:

По функциональным свойствам делятся на киллеры, хелперы, супрессоры (СД2, СД4, СД8).

Т-лимфоцитами киллерами (СД2) называют цитотоксические Т-лимфоциты, способные разрушать микроорганизмы, клетки организма, содержащие вирусы и бактерии и перерожденные измененные клетки организма. Разрушение клеток-мишеней происходит при прямом контакте с клетками за счет выделения лимфотоксина. Эти клетки очень устойчивы в организме и длительно живущие.

Т-лимфоциты хелперы(СД4) выполняют посредническую, сигнальную функцию, передавая информацию об антигенах Б-лимфоцитам. В гуморальном иммунном ответе они реагируют с гаптеном тимусзависимого антигена, индуцируя превращения Б-лимфоцитов в плазмоциты. В их присутствии синтез антител плазмоцитами увеличивается в 2-3 раза. Также относятся к группе долгоживущих лимфоцитов.

Т-лимфоциты супрессоры(СД8) являются регуляторами антителообразования и других иммунных процессов и участвуют в формировании иммунологической памяти. Длительно живущие клоны лимфоцитов СД2, СД4 и СД8 составляют основу клеточной иммунной памяти. В крови на долю Т-лимфоцитов приходится 50-70 % всех лимфоцитов.

Б - лимфоциты

Б-лимфоциты составляют 15 - 35 % всех лимфоцитов, циркулирующих в крови.

Б-лимфоциты развиваются в костном мозге. Затем Б-лимфоциты распространяются током крови в специфические области периферической лимфоидной ткани. После стимуляции специфическим антигеном Б-лимфоциты трансформируются в плазмациты. Плазматические клетки синтезируют иммуноглобулины (антитела), которые являются специфичными белками для антигена.

Образование циркулирующих антител, специфичных для антигенов - основа приобретенного гуморального иммунитета. Выделяют 5 классов иммуноглобулинов (A, E, G, D, M)

Тромбоциты

Бесцветные круглые пластинки, имеющие двояковыпуклую форму, по величине в 2 - 8 раз меньше эритроцитов. Тромбоциты живут всего 8-12 суток. Они, по сути,- это «служба МЧС» в организме.

Длятого чтобы организм оставался живым, необходимы среди прочих такие два условия, как жидкое состояние крови и целостность, или замкнутость, кровеносного русла. Эти условия обеспечиваются за счет системы свертывания крови . Именно эта система сохраняет циркулирующую кровь в жидком состоянии и восстанавливает целостность сосудистого русла, образуя кровяные сгустки (тромбы) в поврежденных сосудах. Для исследования тромбоцитов обычно делают специальный анализ - коагулограмму, по результатам которого оценивают состояние свертывающей системы крови (гемостаз).

Плазма крови

Плазма крови на 90-92 % состоит из воды, а остальные 8-10 % приходятся на многочисленные растворенные в ней вещества. В основном это белки - 7-8 %: альбумины (около 4,5 %), глобулины (2 - 3 %) и фибриноген.

Другие азотистые вещества в плазме:

а) Аминокислоты и «обрывки» белков пищи, которые всасываются в пищеварительном тракте и используются клетками организма для синтеза собственных белков;

б) Продукты распада собственных белков и нуклеиновых кислот - мочевина, креатин, креатинин, мочевая кислота, которые должны быть выведены из организма. Мочевина составляет примерно половину всего количества небелкового азота в плазме крови (остаточного азота).

В плазме присутствуют также органические вещества, не содержащие азота, - глюкоза, нейтральные жиры и липиды. Около 0,9 % всех веществ, содержащихся в плазме, являются солями натрия, калия и кальция.

В плазме крови содержатся гормоны, ферменты, антигены, антитела и вообще все, что должно быть доставлено из одного места организма в другое.

Концентрация любого из этих веществ определяется при биохимических исследованиях крови, и этих анализов существует столько, сколько веществ циркулирует в крови.

Обычно биохимические анализы назначаются при подозрении на конкретное заболевание с целью определить содержание или установить сам факт наличия конкретного вещества.

1298 0

В первой половине 1970-х годов Т. Timonen и R. Herberman описали ранее неизвестную субпопуляцию лимфоцитов, которые были определены как естественные киллерные клетки или естественные киллеры (ЕК) (NK - natural killers).

Впервые клетки этой субпопуляции выявили у человека и мышей, а затем - практически у всех млекопитающих (крысы, хомячки, кошки, обезьяны, собаки), а также рыб и птиц.

В течение трех десятилетий эти клетки являются объектом активного изучения.

В частности, у рыб родов Tilaria, Catfish, Teleost эти клетки играют важную роль во врожденном иммунитете и в отличие от естественных киллеров млекопитающих секретируют растворимую, но не экспрессируют мембранно-связанную, цитокиноподобную форму FasL и экспрессируют молекулу, которая функционирует как антигенраспознаюший рецептор. Поскольку эти клетки в настоящее время рассматриваются как эквивалент ЕК, активированных IL-2 (ЛАК), то они могут служить очень удачной филогенетической моделью для изучения механизмов распознавания ЕК.

Успехи в изучении естественных киллеров млекопитающих были обеспечены усилиями различных авторов, среди которых в первую очередь следует отметить: R. Herberman, М. Robertson, Т. Whiteside, R. Zinkernagel, D. Kagi, L. Lanier, J. Phillips, A. Cerwenka, A. Moretta, L. Moretta, N. Vujanovic и многих других.

Интерес к изучению ЕК обусловлен рядом причин и прежде всего тем, что система ЕК является одной из наиболее древних в эволюционном плане. Это определяет их центральную роль во врожденном иммунитете и их большое значение при различных физиологических и патологических процессах.

Расширение исследований молекулярных механизмов распознавания привело к получению новой информации, согласно которой естественные киллеры способны распознавать классические молекулы антигенов I класса главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) , неклассические молекулы антигенов I класса ГКГ и молекулы, ассоциированные с антигенами I класса главного комплекса гистосовместимости.

Цитотоксическое действие ЕК особенно важно в организме с развиваюшейся опухолью, потому что, осуществляя функции противоопухолевого надзора, они обладают способностью взаимодействовать с опухолевыми клетками на различных этапах их дифференцировки. Наконец, чрезвычайно важным является то обстоятельство, что ЕК осуществляют контроль за метастазированием.

С точки зрения оценки роли естественных киллеров в процессе метастазирования представляют интерес данные о том, что удаление ЕК приводит к еще более резкому увеличению метастазов, чем у перфориндефицитных мышей. Из этих данных следует, что в контроле за метастазированием ЕК используют как перфоринзависимый, так и перфориннезависимый пути.

Естественные киллеры имеют костно-мозговое происхождение, однако не проявляют цитотоксического действия в костном мозгу, их созревание не связано с тимусом, они присутствуют во всех органах и периферической крови. По своей структуре ЕК относятся к большим гранулярным лимфоцитам и их морфологические и ультраструктурные свойства изучены достаточно подробно.

Основными маркерами ЕК являются CD16 (FCyRIII), который экспрессируют лишь 14-16 % клеток и CD56; 70 % естественных киллеров экспрессируют CD7, который функционирует как ко-стимулирующая молекула, является индуктором адгезии и от 30 до 60 % CD11с; ЕК не экспрессируют CD3, не имеют TCR.

Одной из отличительных особенностей ЕК по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ) служит их способность осуществлять спонтанную цитотоксичность, которая не требует предварительной сенсибилизации и не рестриктирована антигенами ГКГ. Подобно другим клеткам системы иммунитета, естественные киллеры - гетерогенная субпопуляция и отдельные клоны этих клеток могут быть идентифицированы по ряду признаков, в первую очередь - фенотипически и функционально.

Наряду с центральной функцией - цитотоксичностью, ЕК выполняют и другие функции: участвуют в регуляции взаимодействия различных клеток системы иммунитета в норме и при патологии. Активность ЕК регулируется множеством цитокинов, которые продуцируются какгемопоэтическими, так и негемопоэтическими клетками, а также экзогенными факторами разнообразной природы.

Основными регуляторами активности естественных киллеры, как известно, являются IFNy, IL-2, IL-4, IL-15, IL-21. Наличие большого количества информации, касающейся естественных киллеров, их свойств и особенностей избавляет от необходимости подробного изложения этих данных. Поэтому ниже представлены данные о роли ЕК в опухолевом процессе с акцентом на наиболее важных аспектах. При этом важно обратить внимание на следующее.

Достаточно распространена точка зрения, согласно которой роль ЕК важна преимущественно на первых этапах опухолевого процесса, и по мере роста опухоли их роль в деструкции опухолевых клеток уменьшается, уступая место другим клеткам, в частности ЦТЛ.

Тем не менее еще в начале 1980-х годов R. Herberman и соавт. показали, что естественные киллеры осуществляют контроль за диссиминацией и метастазированием опухолевых клеток. Вначале этот важный вывод был аргументирован результатами опытов с меланомой и опухолевыми клетками линии 3LL. Было показано, что введение сыворотки крови, содержащей антиазиало-СМ-антитела, которые избирательно ингибируют ЕК, приводит к быстрому метастазированию в легкие.

Последующие исследования на модели аденокарциномы грудной железы (MADB106) подтвердили предыдущий вывод - перенос очищенной фракции больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ) мышам, у которых функция ЕК была подавлена указанным выше образом, приводил к удалению потенциально метастазирующих опухолевых клеток из циркуляции.

Дальнейшим сравнительным изучением роли цитотоксических лимфоцитов и естественных киллеров в контроле за опухолевым ростом с учетом особенностей клинического течения установлено, что главенствующее место в этом контроле принадлежит ЕК. Такие данные получены при исследовании меланомы увеальной радужной оболочки глаза, которая характеризуется злокачественным течением и быстрым метастазированием.

Различные клоны естественных киллеров

Попытки выделить различные клоны ЕК начали предприниматься вскоре после идентификации этой субпопуляции клеток. Первые из них относились к выявлению различных поверхностных антигенов, экспрессируемых лимфоцитами. Уже на начальных этапах таких исследований было отмечено, что ЕК представлены клетками, различающимися фенотипически и функционально.

Показано также, что БГЛ, к которым относятся естественные киллеры, не прилипают ни к пластику, ни к нейлону, однако среди них было выделено две фракции в градиенте фиколла, отличающихся по плотности экспрессии Е-рецептора; фракция с высокой плотностью Е-рецептора обладала большим аффинитетом к образованию розеток.

После того как было установлено, что ЕК лизируют клетки-мишени, удалось выделить клоны ЕК, одни из которых осуществляют антителозависимую цитотоксичность, а другие - лектинзависимую и не идентичны по способности к лизису различных мишеней. Высказано предположение, что такая гетерогенность может быть обусловлена наличием вариантов в зависимости от уровня дифференцировки естественных киллеров и/или их активности.

Несмотря на известный факт, согласно которому неактивированные ЕК не прилипают к пластику, в последующем было показано, что после активации IL-2 выделяются две фракции: клетки, прилипающие и не прилипающие к пластику; прилипающие ЕК (CD3-CD56+) характеризовались выраженной способностью к лизису клеток-мишеней.

Дальнейшими исследованиями установлено, что процент прилипающих естественных киллеров зависел от времени инкубации с IL-2 и их цитотоксичность блокировалась антителами против IL-2RP, ICAM-1, CD2 и LFA-3, но не антителами к lL-2Ra или СD56-антигену; фракция прилипающих естественных киллеров была обогащена клетками CD56(dim) и CD16(dim), которые экспрессировали IL-2Ra и IL-2Rв.

Отмечено также, что прилипающие ЕК активно пролиферировали, имели низкую плотность антигена CD56, проявляли высокий уровень цитотоксичности против К562-мишеней (по сравнению с фракцией, содержащей неприлипающие клетки), однако цитотоксичность против клеток линии Daudi была сходной. Фенотипически естественные киллеры могут отличаться и по плотности поверхностного маркера CD56 - CD56(bright) и CD56(dim).

Значительное число исследователей при идентификации различных клонов ЕК, наряду с фенотипическими свойствами, учитывали и функциональную активность рецепторов естественных киллеров (ЕКР) .

В настоящее время стало известно, что ЕК различаются и по их роли в иммунологическом ответе.

В частности, CD56(dim) естественных киллеров субпопуляция проявляет большую цитотоксичность, экспрессирует высокий уровень иммуноглобулиноподобных ЕК-рецепторов и FcyRIII (CD16) по сравнению с клетками CD56(bright). В отличие от этого последние обладают выраженной способностью продуцировать цитокины после активации моноцитами, но имеют низкую цитотоксичность и экспрессируют либо CD16(dim), либо вообще не имеют этого маркера; существует гетерогенность и по другим функциональным свойствам упомянутых субпопуляций.

В результате распределения ЕК по плотности экспрессии CD56-CD56(bright) и CD56(dim), стало возможным получить данные и о других различиях этих клеток. В частности, выяснилось, что CD56(bright) экспрессируют несколько изоформ ингибиторных иммуноглобулиноподобных рецепторов - CD158a, CD158b, NKB1, в то время каклекти-ноподобный рецептор - CD94/NKG2, выявлен на клетках обоих субпопуляций.

Установлено также, что ЕК этих субпопуляций имеют различия и по способности продуцировать цитокины, а также оказывать цитотоксическое действие: CD56(bright) продуцируют IFNy и TNFa, но проявляют слабую цитотоксичность, что может быть связано со снижением способности формировать конъюгаты с клетками-мишенями и низким содержанием перфорин-гранзимов в их гранулах. Авторы этих интересных исследований рассматривали CD56(bright) как специализированные естественные киллеры, которые регулируют иммунологический ответ, в первую очередь путем продукции цитокинов.

При исследовании ЕК с различной плотностью экспрессии CD56 учитывались и другие характеристики. Так, было показано, что клетки с высокой плотностью экспрессии антигена CD56 (CD56+hi ЕК) экспрессируют более высокий уровень CD25, CD 122, CD45R0 и более низкий уровень CD45RA по сравнению с клетками с низкой плотностью CD56 (CD56+lo ЕК); CD56+hi экспрессируют высокий уровень ко-стимулирующих молекул CD2, CD7, что предполагает их более выраженную способность к ответу на различные стимулы; клетки этого же клона экспрессируют и различные адгезивные молекулы.

Представляет существенный интерес то, что указанные клоны различаются по характеру экспрессии CD16, что может быть причиной необходимости различных условий для активации клеток каждого из этих клонов. Например, CD56+hi не экспрессируют или имеют низкий уровень CD16, что объясняет их низкую способность к антителозависимой цитотоксичности, однако наряду с этим они характеризуются высокой активностью лектинподобных рецепторов.

Описаны два клона и по плотности активационных рецепторов - EKP(bright) и EKP(bull); установлено, что различные естественные киллеры имеют разные соотношения этих клонов и очень варьируют по своей цитотоксичности. При некоторой патологии, например при миелоидной лейкемии, большинство ЕК экспрессируют фенотип "bull".

На основании этих новых данных, авторы пришли к заключению, что плотность триггерных рецепторов определяет цитотоксичность, но эти рецепторы различаются по чувствительности к некоторым цитокинам, в частности TGF-1, который снижает экспрессию NKp30 и частично NKG2D, но не влияет на NKp46. Из этого следует, что опухолевые клетки, продуцирующие TGF-1, могут приобретать резистентность к ЕК-лизису.

Выделяются клоны и по способности к продукции IFNy - ЕК1 и ЕК2, (возможна аналогия с Тh1 и Th2). Естественные киллеры, продуцирующие IFNy, не секретируют IL-4, IL-5 и IL-13, в отличие от ЕК, которые не продуцируют IFNy, а продуцируют IL-4, IL-5, IL-13; эти данные показывают, что циркулирующие ЕК человека имеют различный цитокиновый профиль, а соответственно могут играть и различную роль в воспалении.

Способностью лизировать различные мишени в зависимости от экспрессии высоко- и низкоаффинных рецепторов IL-2 объясняют наличие гетерогенности естественных киллеров и другие исследователи. Так, в общей популяции ЕК одни клетки экспрессируют а-цепь IL-2R, а другие - в-цепь, соответственно и лизируют различные клетки-мишени; указанные различия в способности к лизису авторы объясняют установленной ими гетерогенностью в гене, контролирующем лизис мишеней.

По способности ответа на хемокины идентифицированы два клона ЕК человека - CD56(dim)CD16+ и CD56(bright)CD16- Покоящиеся CD56(dim)CD16+ экспрессируют CXCR1, CXCR2, CXCR3 и CX3CR, не экспрессируют рецепторы для хемокинов семейства СС, мигрируют в ответ на CXCL12 и CXC3L1.

В отличие от этого покоящиеся CD56(bright)CD16- экспрессируют небольшое количество CXCR1, CXCR2, CXC3R1, но высокий уровень CCR5 и CCR7; указанные клоны естественных киллеров разделяются по характеру своего ответа на отдельные цитокины, что проявляется различием в уровне их цитотоксичности и пролиферации.

Следует обратить внимание, что in vivo в активном лизисе опухолевых клеток участвуют ЕК, которые продуцируют CCL19 или CCL21 - хемокины, играющие важную роль в афферентном и эфферентном ответе ЕК на опухолевые клетки и инфекцию.

В общей популяции естественных киллеров существуют и клоны, различающиеся по способности экспрессировать ингибиторные и триггерные рецепторы; соответствующие данные по этому вопросу представлены в разделе о рецепторах ЕК.

Как следует из упомянутых данных, ЕК гетерогенны по своему составу и различаются по ряду параметров. Несмотря на то что выявление отдельных клонов происходило по различным критериям, в подавляющем большинстве случаев окончательным критерием оценки гетерогенности была их способность к лизису.

Бережная Н.М., Чехун В.Ф.

Аннотация

NK-клетки характеризуются как не В-клетки и не Т-клетки, лишённые характеристик зрелых макрофагов, которые развиваются из клеток костного мозга независимо от влияния тимуса. NK-клетки играют решающую роль в гибели опухоли, иммунологическом надзоре, сопротивляемости инфекциям и иммунном регулировании процессов организма. Разрушение нормальными киллерами раковых клеток включает в себя определенную последовательность событий. Во-первых, клетка NK распознает раковую клетку и привязывается к ней. Этот процесс требует межрецепторного взаимодействия. NK-клетка выделяет гранулы, которые проникают в раковую клетку и в конечном итоге убивают ее. После чего NK-клетка освобождается для привязки к другой раковой клетке и процесс повторяется.

Однако раковые клетки знают, как вести своего рода клеточную войну. Мы впервые в нашей лаборатории открыли, что раковые клетки могут уничтожать лейкоциты посредством фагоцитоза. Мы наблюдали три способа, которыми это делается. Раковая клетка может окружить с двух сторон лейкоциты или может создать чашеобразное отверстие, внутрь которого затягиваются лейкоциты. Третий способ заключается в том, что раковая клетка вытягивает длинное плечо, чтобы захватить лейкоцит и, в конце концов, затянуть его внутрь раковой клетки, где он переварится. Кроме того, другие работы показали, что раковые клетки выделяют иммуносупресивные вещества, которые ослабляют функцию иммунной системы.

За последние 25 лет были сделаны многочисленные попытки укрепления иммунной системы с помощью различных модификаторов биологической реакции (МБР). Эти вещества, создаются из бактерий и грибков, которые обладают иммунорегуляторными свойствами. Кроме того, некоторые виды цитокинов работают подобно МБР, например, интерфероны, интерлейкин-2 и интерлейкин-12. Есть две проблемы, связанные с этими МБР: 1) токсичность, 2) развитие низкой реактивности, при которой однократное введение МБР может значительно повысить активность клеток NK, но повторное введение того же МБР приведет к депрессии активности NK-клеток. Интересно отметить, что BioBran имеет преимущества перед другими МБР. Он нетоксичен и не показал низкой реактивности за четыре года наблюдений. Настоящая работа была проведена с целью изучения влияния нового МБР, известного под названием BioBran, на функцию NK-клетки и пролиферацию Т-и В-клеток у 32 пациентов. У отдельных пациентов были зарегистрированы опухолевые антигены.

Пациенты

Настоящее исследование проводилось на 32 пациентах страдающих от раковых заболеваний. У пациентов были различные типы опухоли: простаты, молочной железы, множественная миелома и лейкемия. Большинство пациентов прошли через циторедукцию при помощи традиционных видов терапии, таких как хирургическое вмешательство, лучевая терапия или химиотерапия.

Материалы

BioBran – это арабиноксилан, полученный из экстракта рисовых отрубей, обработанный под воздействием ферментов из грибов шиитаке. Это полисахарид, который содержит гемицеллюлозу. Торговое название BioBraп – BioBran MGN-3 (компания Daiwa Pharmaceuticals, Co., Ltd., Токио, Япония).

Методы

Протокол лечения. Пациентами давали BioBran (3 г в день) ежедневно перорально.

Опухолевый специфический антиген (ОСА). ОСА для каждого типа опухоли измерялся до начала лечения препаратом BioBran и через месяц после лечения.

Линия опухолевых клеток. К562, клетки эритролейкемической линии человека, использовались в качестве целевой. Опухолевые клетки культивировались в полной среде, состоящей из RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% антибиотика (100 единиц пенициллина и 100 г\мл стрептомицина).

Препарат лимфоцитов периферической крови (ЛПК). ЛПК были приготовлены из свежей гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Hypaque. Клетки были два раза промыты сбалансированным солевым раствором Хенкса и ресуспендированы до концентрации 10 х 106 кл\мл в общей среде.

51CR – анализ для измерения активности NK-клеток. Активность нормальных киллеров измерялась стандартным 4-х часовым 51CR- анализом. Вкратце, 1х104 опухолевые целевые клетки, меченные Cr в 0.1 мл обшей среды добавлялись в различные лунки 96-луночного титрационного планшета. Затем клетки-эффекторы пипеткой переносились в ячейки в 4 копиях, чтобы получить соотношение клеток-эффекторов к целевым клеткам (E:T) 12:1, 25:1, 50:1 и 100:1. После 4 часового инкубационного периода при температуре37 °C, планшеты были центрифугированы (1 400 об\мин в течение 5 минут) и было собрано 0.1 мл центрифугата из каждой лунки и пересчитано по гамма-счетчику (Beckmann G50, Beckmann Instruments).

Процент освобождённых изотопов рассчитывался по следующей формуле:

Спонтанное освобождение из целевых клеток составило не боле 8-10% от общего освобождения. Общее освобождение измерялось прибавлением 0.1мл Тритона Х-100 (Sigma Chemical Co.) в назначенные лунки. Единицы лизиса рассчитывались из кривых титрования эффектора с одной определённой единицей лизиса, так как требовалось, чтобы количество клеток-эффекторов достигло 20% лизиса для К562.

Гранулярность естественных киллеров. Выделение лимфоцитов периферической крови в градиенте перколла было настроено на 2.5=10.6\мл и центрифугировано на слайдах при 1 000 об\мин в течение 5 минут при помощи цитоцентрифуги (Shanton Southern Institute, Сеуикли, Пенсильвания). Слайды были высушены в воздушной сушке, фиксированы метанолом, окрашены 5% раствором Гимзе в течение 10 минут. Окрашенные препараты были изучены на предмет гранулярности NK-клеток.

В естественных условиях пролиферация T-лимфоцитов и В-лимфоцитов. Мы исследовали влияние в естественных условиях BioBran на пролиферацию Т-клеток и В-клеток при помощи тимидина. Мононуклеарные клетки были подготовлены из периферической крови пяти раковых пациентов до лечения BioBran и через месяц после лечения. Клетки были инкубированы при 2х105 кл\мл в общей среде. Клетки были обработаны фитогемагглютинином (10г\мл), конканавалином А или митогеном лаконоса в течение 3 дней. На последние 18 часов к культурам клетки был добавлен меченый тритием тимидин. Были собраны образцы ДНК и определено накопления тимидина при помощи сцинтиллоскопа. Все эксперименты проводились в трех повторениях, данные выражены, как число импульсов в минуту.

Статистический анализ. Т-критерий Стьюдента применялся для изучения значимости отклонений между активностью NK-клеток и реакцией Т- и В-клеток на митогены до и после лечения препаратом BioBran.

Результаты

1. Активность NK -клеток

Рисунок 1 показывает базовые значения цитотоксичных ответов NK-клеток у 32 пациентов, больных раком. У пациентов отмечался общий низкий уровень функции NK-клеток. Депрессия активности NK-клеток наблюдалась у пациентов с разными типами опухолей: простаты, 11.1 единиц лизиса; молочной железы 11.4 единиц лизиса; множественная миелома, 7.3 единиц лизиса; лейкемия 4.3 единиц лизиса. Исследования лимфоцитов периферической крови у 12 участников спустя 1-2 недели после первичного исследования, не выявили статистически значимых различий в активности NK-клеток по сравнению с первоначальными результатами. Лечение MGN-3 показало значительное повышение активности NK-клеток до десяти раз. Усиливающий эффект MGN-3 был выявлен при всех типах опухолей: простаты 41.9 единиц лизиса; молочная железа 33 единиц лизиса; множественная миелома 31.9 единиц лизиса; лейкемия 51.4 единиц лизиса.

Рисунок 1. Влияние BioBran на активность NK-клеток у 32 пациентов от одной до двух недель после лечения. Типы опухолей: простата (10), молочная железа (12), множественная миелома (5), лейкемия (5). Единицы лизиса при 20% *р < 0.001

2. Гранулярность NK -клеток.

Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови до лечения показала низкую гранулярность или ее отсутствие (рис.2а).

Рисунок 2(а) . Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови. NK-клетки были взяты от ракового пациента до начала лечения BioBran. Обратите внимание на ядерно-плазменное отношение и отсутствие гранул.

Рисунок 2(b ). Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови того же пациента через 1 неделю после лечения BioBran. Клетки демонстрируют высокое гранулярное содержание.

С другой стороны, лечение BioBran показало значительное повышение гранулярного содержания через 1 неделю после лечения (рис. 2b). Активированные BioBran NK-клетки показали повышение связывающей способности и способности уничтожать раковые клетки (рис. 3).

Рисунок 3. Препарат цитоцентрифугирования опухолевой клетки К562. NK-клетки были активированы BioBran. (а) Первый шаг процесса представлен связыванием NK-клетки к клеткой опухоли. (b) Одна опухолевая клетка мертва. (с) Обе опухолевые клетки мертвы, а NK-клетка все еще активна. (d) NK-клетка самостоятельно отделяется от мертвых опухолевых клеток.

3. Пролиферация в естественных условиях Т- и В-лимфоцитов

Рисунок 4 показывает, что лечение BioBran значительно повысило пролиферацию Т-клеткок, это показывает реакция на митогены: фитогемагглютинин и конканавалин А. Пролиферация В-клеток также повысилась после лечения BioBran, о чем свидетельствует реакция на митоген лаконоса, по сравнению с базовым значением.

PHA – фитогемагглютинин, Con A - конканавалин А, PWM - митоген лаконоса

Рисунок 4. Действие BioBran в ответ на митоген. Т- и В-клетки через месяц после лечения. Мононуклеарные клетки были культивированы из периферической крови в присутствии фитогемагглютинина, конканавалина А и митогена лаконоса. Данные представляют среднее значение (стандартное отклонение у пяти человек.) *р<0.001.

4. ОСА и активность естественных киллеров у отдельных пациентов

Пациентов проверили на предмет опухолевого специфического антигена: простата, простат специфический антиген (ПСА); множественная миелома, белок Бен-Джонса (ББД) или ICg. Рак молочной железы проверялся при помощи РЭА и КТ сканирования от одного до двух раз в год. Был проведен анализ различных типов злокачественных опухолей у отдельных пациентов.

Пациент К, 39 лет. Был поставлен диагноз острый миелогенный лейкоз. Была проведена химиотерапия, в результате которой число лейкоцитов составило 5.6, при норме от 4.5 до 10.5. Химиотерапия была прекращена и пациент начал принимать BioBran в январе 1995 года. Показатели лейкоцитов оставались в норме с того времени. Активность NK-клеток пациента составила 7.9 единиц лизиса и повысилась до 113 единиц лизиса через одну неделю после лечения BioBran. Уровень активности NK-клеток остается высоким уже в течение 4 лет.

Пациент Y, 52 года, менеджер магазина из Японии. Ему также был поставлен диагноз острый миелогенный лейкоз. Он отказался от традиционного лечение. Количество лейкоцитов 31 марта 1998 года составило 18 700\мл. Пациент начал принимать BioBran.и 30 апреля число лейкоцитов упало до 11 000. С того времени его состояние остается стабильным.

В 1994 году R обратился к нам по поводу рака простаты. Гормональная терапия привела к тому, что уровень ПСА был 0.1, но известно, что маркёр со временем снова повышается. Пациенту начали давать BioBran.и уровень ПСА остается в норме последние 4 года.

М, пациентка, у которой возник рецидив рака молочной железы в апреле 1995 года. До этого ей была проведена операция, за которой последовала химиотерапия. Она начала прием BioBran после завершения курса химиотерапии и с тех пор компьютерная томография показывала хорошие результаты. Больше не было признаков рецидива заболевания, согласно компьютерной томографии и биопсии. Активность NK-клеток пациентки составила 16.4 единицы лизиса. Это увеличенные в два раза показатели после одной недели лечения BioBran. Активность продолжала увеличиваться до 128 единиц лизиса и остается на высоком уровне в последние годы.

Обсуждение

BioBran считается сильным модификатором биологического ответа, о чем свидетельствует повышенная активность NK-клеток у животных и человека. Интраперитонеальная инъекция мышам BioBran показала повышение активности NK-клеток в несколько раз через два дня после лечения. Другие исследования на крысах, в которых BioBran применялся вместе с пищей, также показал повышение активности NK-клеток в зависимости от применяемой дозы. Исследования проводились и на здоровых участниках, которые принимали BioBran перорально. Повышение активности NK-клеток в 2-3 раза наблюдалось через неделю после лечения BioBran в дозе 30 и 45 мг\кг в день, а более низкие дозы 15 мг\кг в день показали повышение активности в два раза только через месяц.

По нашему мнению, особенный интерес представляет исследование стимулирующего влияния BioBran на активность NK-клеток у пациентов с наличием злокачественного новообразования. Пациенты прошли химиотерапию и лучевую терапию, так как требовалась циторедукция. Однако в результате этих воздействий активность естественных киллеров снижалась. Учитывая потребность организма в естественном иммунитете, мы поняли, что усиление активности NK-клеток может оказаться клинически крайне важным для уничтожения оставшихся раковых клеткок, которые не были уничтожены во время лучевой и химиотерапии. Возможно усилить активность NK-клеток за счет применения различных модификаторов биологического отклика. Однако токсичность и низкий иммунологический ответ ограничивают их применение. BioBran является безопасным продуктом, у пациентов не развивалась устойчивость к иммуному ответу на препарат во время 4 лет проведения исследования. За активностью NK-клеток велось наблюдение, чтобы можно было задокументировать все изменения в активности циркулирующих иммуноцитов во время терапии с данными препаратами. Было выявлено усиление активности NK-клеток благодаря BioBran уже через 1-2 недели после лечения, и эта активность удерживалась на высоком уровне при продолжении лечения BioBran.

Циторедукция, за которой следовала иммунотерапия BioBran применялась к 32 пациентам, больным раком. Кроме повышения активности NK-клеток, пациенты показали постепенное снижение уровня опухоль специфического онтигена без признаков увеличения в течение 4 лет, пока проводилось исследование.

Изучались механизмы, благодаря которым BioBran повышает активность NK-клеток. Согласно нашим исследованиям, два механизма отвечают за активность NK-клеток, вызванную BioBran. Во-первых, это происходит за счет гранулярности NK-клеток, во-вторых – за счет повышения производства цитокина. Что касается гранулярности, NK- клетки наших пациентов имели либо низкую гранулярность, либо ее полное отсутствие. Примечательно, что лечение BioBran значительно повышало гранулярное содержание NK-клеток (Рис. 2). Гранулы располагаются не только в порции цитоплазмы, но также и между ядерными и клеточными мембранами. Экзоцитоз гранул NK-клеток и секреция молекул, формирующих поры (перфорины), хранящиеся как цитоплазмические гранулы могут представлять один из важнейших механизмов для уничтожения клеток рака системой NK-клеток. Важная роль гранул при уничтожении опухолевых клеток NK-клетками была выявлена при наблюдении за изолированными и очищенными гранулами. Они обладают разлагающим воздействием на разные типы опухолевых клеток. Следовательно, мы полагаем, что повышенный уровень гранулярности NK-клеток является важным фактором для усиления клеточного ответа на гибель рака благодаря применению BioBran.

Что касается цитокинов, было выявлено, что сразу несколько цитокинов влияют на пролиферацию NK-клеток или на цитолитическую активность. Большему изучению подверглись интерфероны и ИЛ-2. Подавление активности NK-клеток у раковых пациентов была связана с недостаточным производством лимфокина. Предположительно, усиление цитотоксической функции NK-клеток за счет введения BioBran совпадает со значительным повышением уровней различных цитокинов. Грануляция больших гранулярных лимфоцитов может указывать на секреторную функцию. Пока не известно является ли производство различных лимфокинов полифункциональным свойством подгруппы больших зернистых лимфоцитов. Более вероятно, что различные подгруппы больших зернистых лимфоцитов ответственны за различные лимфокины. В лабораторных исследованиях было выявлено, что лечение BioBran значительно повышает производство ФНО-альфа и интерферонов. Кроме того, пациенты с различными типами злокачественных опухолей показали повышение уровней ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-альфа после лечения BioBran.

Наша работа показала первичный эффект BioBran на NK-клетки. Однако есть данные, полученные от здоровых контрольных участников исследования, что другие иммуноциты, Т- и В-клетки показали усиление своих функций после лечения. В данном исследовании мы выявили, что у пациентов были усилены функции Т- и В-клеток, как доказательство реакции пролиферации на разные митогены. Это доказывает, что BioBran вызывает общую стимуляцию иммунитета.

Предварительные результаты настоящего исследования достаточны для проведения дальнейших клинических исследований.